Методы

Концентрирование ГБ метом ультрафильтрации

Объединённые фракции трёх с трёх разрушений объёмом 81 мл разбавили буфером (20 мМ Трис HCl, 1 мМ ЭДТА, pH 8.5) в 3,5 раза до 300 мл (концентрация белка 0,19 мг/мл) и концентрировали на приборе для ультрафильтрации Amicon (мембрана YM 30) в 15 раз. В результате получили 20 мл раствора с концентрацией ГБ 2,2 мг/мл.

Сайтспецифическое расщепление гибридного белка TEV протеазой.

К концентрату добавили экстракт телец TEV до соотношения фермент-субстрат 1:100 и дитиотриэтол до 1мМ, инкубировали 15 часов при 37oС. Реакционную смесь нанесли на колонку HiTrap Heparin Sepharose (5 мл) и хроматографироговали по ранее описанной методике. Фракции, содержащие целевой белок были объединены и сконцентрированы.

Высокоэффективная жидкостная хроматография на колонке Диасорб С18

Очистку осуществляли на колонке Диасорб-130 -С16Т 7 мкм, 16Ч250 мм в градиенте концентрации 30%-50% ацетонитрила с 0,1% ТФУ при скорости потока 5 мл/мин в течение 35 мин. Фракции, содержащие чистотой более 98%, объединяли и лиофилизировали. Итоговый белок - 11,5 мг.