Методы
Культивирование штамма ER2566/pTTS-VEGF165
Плазмидой pTTS-VEGF165 трансформировали компетентные клетки E. coli ER2566. 300 мл клеточной суспензии перенесли в питательную среду LB объёмом 25 мл содержащую ампицилин (100мкг/мл) инкубировали при 37оС на шейкере при 200об/мин в течении 16 часов. Ночную культуру объёмом 25 мл рассадили в питательную среду 2YT объёмом 250 мл, содержащую ампицилин (100мкг/мл) и инкубировали при 37оС до оптической плотности культуральной среды 0,8 ед. После чего добавляли ИПТГ до конечной концентрации последнего 100 мкг/мл. Инкубировали в течении 4 часов при 37оС.
Выделение и очистка hVEGF165
Биомассу штамма ER2566/pTTS-VEGF165 (5г) ресуспендировали в 50 мл буфера (50 мМ ТрисHCl, 5мМ ЭДТА, 0,2% PMSF, pH 9.0) и лизировали с помощью ультразвукового дезинтегратора (15 с, амплитуда 40%) во льду в течении 30 минут. После дезинтеграции гомогенат центрифугировали в течение 30 мин (15000g, +4oC). Суммарное содержание белка в полученном супернатанте составило 473 мг. Осветлённый лизат объёмом 50 мл разбавили дистиллированной водой до объёма 100 мл и нанесли со скоростью 1 мл/мин на колонку (20 мл) заполненную анионообменым сорбентом Q XL уравновешенным буфером А (20 мМ ТрисHCl, 1 мМ ЭДТА, pH 9,0). Элюировали градиентом буфера Б (20 мМ ТрисHCl, 1 мМ ЭДТА, 1 М NaCl, pH 9,0) 0% до 70% со скоростью 1,5 мл/мин. Фракции анализировали методом ПААГ электрофореза в денатурирующих условиях. Фракции, содержащие hVEGF 165, были объединены. Выход белка составил 7 мг с литра культуры.
Создание штамма продуцента Origami(DE3) /pTrx-VEGF165
К 10 мкл раствора, содержащего 0,5 мкг гена hVEGF165 фланкированного сайтами Xho I и Nco I и 0,3 мкг плазмиды pTVG добавили 4мкл 10Чбуфера Tango 4 мкл дистиллированной воды и по 1 мкл (10 е.а./мкл) эндонуклеаз рестриции Xho I и Nco I. Инкубировали реакционную смесь в течении 90 мин при 37о С. Реакционную смесь разделяли на 1% агарозном геле. Экстрагировали продукты ферментативного расщепления из агарозного геля набором фирмы QIAGEN. К 15 мкл экстракта добавили 2 мкл 5 мМ раствора АТФ, 2 мкл 10Чбуфера для полинуклеотидкиназы фага Т4, 1 мкл (5 е.а./мкл) лигазы. Реакционную смесь инкубировали при 4оС в течение 15 часов. В результате была получена плазмида pTrx-VEGF165.
Культивирование штамма Origami(DE3)/ pTrx-VEGF165
Плазмидой pTrx-VEGF165 трансформировали компетентные клетки E. coli Origami (DE3). 300 мл клеточной суспензии перенесли в питательную среду LB объёмом 25 мл содержащую ампицилин (100мкг/мл) и оставили инкубироваться при 37 оС на шейкере при 200 об/мин в течении 16 часов. Ночную культуру рассадили в питательную среду SOB объёмом 250 мл, содержащей ампицилин (100 мкг/мл) и инкубировали при 30 оС до оптической плотности культуральной среды 0,8. После чего добавляли ИПТГ до конечной концентрации последнего 100 мкг/мл. Инкубировали в течении 16 часов при 30оС.
Выделение и очистка Trx-hVEGF165.
Биомассу E. coli Origami/pTrx-VEGF165 (1 г.) гомогенизировали в 15 мл буфера (50 мМ (Трис)2SO4, 5мМ ЭДТА, 0,2% PMSF, pH 10.0) и лизировали с помощью ультразвукового дезинтегратора (15 с, амплитуда 40%) во льду в течение 30 минут. После дезинтеграции лизат центрифугировали в течение 30 мин (15000g, +4oC). Суммарное содержание белка в полученном супернатанте составило 117 мг. Концентрацию белка определяли методом Бредфорд по стандартному раствору БСА. Супернатант объёмом 15 мл разбавили дистиллированной водой до 30 мл и нанесли со скоростью 1 мл/мин на колонку HiTrap Heparin Sepharose (5 мл) предварительно уравновешенную буфером А (20 мМ (Трис)2SO4, 1 мМ ЭДТА, pH 8.5). Элюировали в течении 50 мин градиентом буфера Б (20 мМ (Трис)2SO4, 1 мМ ЭДТА, 1 М NaCl, pH 8.5) 0% до 100% со скоростью 1,5 мл/мин. Фракции анализировали методом ПААГ электрофореза в денатурирующих условиях. Фракции, содержащие ГБ, были объединены. Количество гибридного белка составило 14.8 мг. Описанную операцию провели ещё раз. Объединённые фракции c двух разрушений содержащие 26,3 мг гибридного белка в 54 мл концентрировали на приборе для ультрафильтрации Amicon (мембрана YM 30) в 4 раза. В результате получили 13 мл раствора с концентрацией ГБ 1,63 мг/мл.