Методы
Создание штамма продуцента ER2566/pTTS-VEGF165
К 10 мкл раствора, содержащего 0,5 мкг плазмиды pET32b+ добавили 4 мкл 10Чбуфера Tango yellow (Fermentas), 4 мкл дистилированой воды и по 1 мкл (10 е.а./мкл) эндонуклеаз рестрикции Eco RI и Hind III. Инкубировали реакционную смесь в течении 90 мин при 37о С. Реакционную смесь разделяли на 1% агарозном геле. Экстрагировали ДНК из агарозного геля набором фирмы QIAGEN согласно протоколу производителя. К 10 мкл экстракта, содержащего 0,5 мкг линеаризованного фрагмента pET32b+ добавили 5 мкл раствора, содержащего 0,5 мкг олигонуклеотидного дуплекса TRX_STOP, 2 мкл 5 мМ раствора АТФ, 2 мкл 10Чбуфера для полинуклеотидкиназы фага Т4 и 1 мкл (5 е.а./мкл) лигазы фага Т4 (Fermentas). Реакционную смесь инкубировали при 4о С в течении 15 часов.
Ген Trx-stop-start амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). В 50 мкл реакционной смеси, содержалось 10 нг матрицы из ранее полученной лигазной смеси, 0,2 мкмоль каждого праймера (PR-1, PR-2), 5 мкл 10´ буфера для Taq-ДНК-полимеразы, SdNTP (каждый в концентрации 0,4 мМ), 2 ед. Taq-ДНК-полимеразы. Инкубацию проводили в ДНК-амплификаторе по следующей программе:
) денатурация 40 сек. при 93°С, отжиг 40 сек. при 58°С, элонгация 30 сек. при 72°С (5 циклов);
) денатурация 30 сек. при 93°С, отжиг 30 сек. при 60°С, элонгация 30 сек. при 72°С (24 цикла).
Продукт ПЦР очищали при помощи набора для очистки ПЦР-продуктов MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN) согласно протоколу фирмы-производителя.
К 10 мкл раствора, содержащего 0,5 мкг плазмиды pTWIN1 (New England Biolabs) добавили 4 мкл 10Чбуфера Orange, 4 мкл дистиллированной воды и по 1 мкл (10 е.а./мкл) эндонуклеаз рестриции XbaI и BamHI. Инкубировали реакционную смесь в течении 90 мин при 37о С. Реакционную смесь разделяли на 1% агарозном геле. Экстрагировали ДНК из агарозного геля набором фирмы QIAGEN согласно протоколу производителя. К 10 мкл очищенного экстракта, содержащего линеаризованный фрагмент pTWIN1 добавили 2 мкл 5 мМ раствора АТФ, 2 мкл 10Чбуфера для полинуклеотидкиназы фага Т4, 5 мкл раствора, содержащего 0,5 мкг олигонуклеотида TTS и 1 мкл (5 е.а./мкл) лигазы. Реакционную смесь инкубировали при 4оС в течение 15 часов. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli ER2566 и рассеивали их на твёрдой питательной среде. Из выросших колоний выделяли плазмиду набором QIAGEN согласно протоколу производителя. К 10 мкл раствора, содержащего 0,5 мкг плазмиды pTTS добавили 2 мкл 10Чбуфера Green (Fermentas), 6 мкл дистиллированной воды и по 1 мкл (10 е.а./мкл) эндонуклеаз рестрикции Xba I и Xho I. Инкубировали реакционную смесь в течении 90 мин при 37оС. Реакционную смесь разделяли на 1% агарозном геле. Экстрагировали ДНК из агарозного геля набором фирмы QIAGEN согласно протоколу производителя. К 10 мкл экстракта, содержащего 0.5 мкг линеаризованной плазмиды pTTS добавили 5 мкл раствора, содержащего 0,3 мкг ранее амплифицированного Trx-stop-start, 2 мкл 5 мМ раствора АТФ, 2 мкл 10Чбуфера для полинуклеотидкиназы фага Т4, 1 мкл (5 е.а./мкл) лигазы. Реакционную смесь инкубировали при 4оС в течение 15 часов. В результате была получена плазмида pTTS-Trx. К 10 мл раствора, содержащего 0,5 мкг плазмиды pTTS-Trx добавили 2 мкл 10Чбуфера Green (Fermentas), 6 мкл дистиллированной воды и по 1 мкл (10 е.а./мкл) эндонуклеаз рестрикции Sap I и Xho I. Инкубировали реакционную смесь в течении 90 мин при 37о С. Реакционную смесь разделяли на 1% агарозном геле. Экстрагировали ДНК из агарозного геля набором фирмы QIAGEN согласно протоколу производителя. К 10 мкл экстракта, содержащего 0,5 мкг линеаризованной плазмиды pTTS Trx добавили 5 мкл раствора, содержащего 0,3 мкг гена hVEGF165, 2 мкл 5 мМ раствора АТФ, 2 мкл 10Чбуфера для полинуклеотидкиназы фага Т4, 1 мкл (5 е.а./мкл) лигазы. Реакционную смесь инкубировали при 4о С в течении 15 часов. В результате была получена плазмида pTTS-VEGF165.