Методики эксперимента

Гомогенность выделенного транскрипта анализировали гель-электрофорезом в 12%-ном денатурирующем ПААГ с последующим окрашиванием геля раствором красителя “Stains-All”.

Транскрипция in vitro и выделение 2'-F-пиримидинсодержащего РНК-транскрипта [54]

Реакцию синтеза 2'-F-РНК проводили в буфере (500 мкл), содержащем 4% (масса/объем) полиэтиленгликоля 8000, 40 мM Tрис-HCl (pH 8.0), 12 мM MgCl2, 5 мM DTT, 1 мM спермидин гидрохлорид, 0.002% (по объему) Tритона X-100, 1 мM ATP, 1 мM GTP, 3 мМ 2'-F-CTP, 3 мM 2'-F-UTP, раствор 250 пмоль дцДНК-библиотеки в буфере (10 мМ Tрис-HCl (pH 8.0), 1 мМ Na2EDTA), 3500 е.а./мл Т7 РНК-полимеразы, при 37°С в течение 7 ч (суховоздушный термостат). По окончании инкубации в реакционную смесь добавляли 10 мкл ДНКазы I, свободной от РНКаз, и инкубировали в течение 15 мин при 37°С (суховоздушный термостат). Затем в реакционную смесь добавляли 100 мМ Na2EDTA (pH 8.0) до концентрации 40 мкM в реакционной смеси и инкубировали при 65°С в течение 10 мин (микротермостат “Модель 206”). К реакционной смеси добавили 50 мкл 3 М CH3CO2Na (pH 5.2) и последовательно экстрагировали смесью фенол:хлороформ (1:1) (500 мкл) и хлороформом (500 мкл). РНК-транскрипт осаждали добавлением 2.5-кратного избытка этанола с последующим выдерживанием при -20°С в течение 10-12 ч. Осадок 2'-F-РНК отделяли центрифугированием (центрифуга Centrifuge 5415 R, Eppendorf, Германия, 13000 об./мин, 10 мин, 4°С), промывали 75%-ным этанолом и сушили при 2-4 мм. рт. ст. в течение 20 мин. Полученный осадок РНК-транскрипта растворяли в буфере А и проводили гель-электрофорез в 12%-ном ПААГ в денатурирующих условиях. Олигонуклеотиды визуализировали в УФ-свете (п. 2.2). Участок геля, содержащий 2'-F-модифицированную РНК-библиотеку, вырезали, заливали 1 мл 0.3 М CH3CO2Na (pH 5.2), перемешивали при комнатной температуре в течение нескольких часов (термостатируемый шейкер Thermomixer compact, 400 об./мин), элюат отбирали, гель промывали 1 мл того же раствора. Олигонуклеотидный материал осаждали этанолом как описано выше. Полученную 2'-F-модифицированную РНК-библиотеку растворяли в бидистиллированной воде и хранили при -20°С.

Гомогенность выделенного транскрипта анализировали гель-электрофорезом в 12%-ном денатурирующем ПААГ с последующим окрашиванием геля раствором красителя “Stains-All”.

Амплификация 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки (по оптимизированному нами протоколу [54])

Обратная транскрипция 2'-F-пиримидинсодержащей РНК-библиотеки 2'-F-РНК (3 пмоль) и 3'-праймер dm 29 (100 пмоль) в 30 мкл бидистиллированной воды предварительно инкубировали при 90°С в течение 2 мин (микротермостат “Модель 206”) и охлаждали до комнатной температуры. Полученный дуплекс 2'-F-РНК и 3'-праймера dm 29 использовали в реакции обратной транскрипции. Синтез кДНК проводили в буфере (50 мкл), содержащем 50 мМ Tрис-HCl (pH 8.0), 8 мM MgCl2, 30 мМ KCl, 1 мМ DTT, 0.5 мМ dGTP, 0.5 мM dATP, 0.5 мM dCTP, 0.5 мM dTTP, 400 е.а./мл AMV RT, при 37°С в течение 30 мин, затем при 48°С в течение 30 мин (термостатируемый шейкер, BIOER, США).

Амплификация кДНК, полученной в ходе обратной транскрипции

Реакционную смесь после обратной транскрипции использовали для последующей амплификации. Реакционная смесь для ПЦР (1000 мкл) содержала 7.5 мМ MgCl2, 1 мM dGTP, 1 мM dATP, 1 мM dCTP, 1 мM dTTP, 2 мкМ 3'-праймера dm 29, 2 мкМ 5'-праймера dm 28/ dm 28 long, 25 е.а./мл Taq ДНК-полимеразы, 10 мМ Tрис-HCl (pH 8.3), 50 мМ KCl. Реакционную смесь переносили в 10 ПЦР-пробирок на 0.5 мл по 100 мкл реакционной смеси в каждую и помещали в амплификатор Mastercycler gradient (Eppendorf, Германия).