Методики эксперимента
Твердофазный фосфитамидный синтез комбинаторной библиотеки олигодезоксирибонуклеотидов
Приготовление растворов мономеров
Качество коммерческих препаратов фосфитамидов, используемых в работе, проверяли методом ТСХ в системе этанол:хлористый метилен (5:95). Защищенные дезоксирибофосфитамиды перед работой сушили над Р2О5 при 2-4 мм рт. ст. в течение 1 ч. Количество мономеров рассчитывали, исходя из того, что на каждую стадию конденсации требуется 60 мкл 0.05 М раствора мономера. Для синтеза константных участков комбинаторной оцДНК-библиотеки растворы фосфитамидов готовили из расчета 0.05 г мономера на 1 мл абс. CH3CN. Для синтеза рандомизированного участка комбинаторной оцДНК-библиотеки смешивали все четыре фосфитамида в одном флаконе из расчета 0.05 г dА-CE, 0.045 г dC-CE, 0.059 г dG-CE и 0.042 г dТ-CE на 1 мл абс. CH3CN. К готовым растворам фосфитамидов добавляли молекулярные сита.
Синтез комбинаторной оцДНК-библиотеки
Синтез вели на синтезаторе ASM-800 (“Биоссет”, Россия) в масштабе 0.4 мкмоль (реактор на 50 мкл) твердофазным фосфитамидным методом согласно протоколу, приведенному в табл. 3.
Таблица 3. Протокол операций автоматического фосфитамидного синтеза олигодезоксирибонуклеотидов
|
№п/п |
Операция |
Реагент |
Кол-во мкл /эквивалентов |
Время, сек |
|
1. |
Промывка |
CH3CN |
280 |
11.6 |
|
2. |
Промывка |
CH2Cl2 |
270 |
9.0 |
|
3. |
Детритилирование |
3% DCA в CH2Cl2 |
325 |
120.0 |
|
4. |
Промывка |
CH3CN |
270 |
10.8 |
|
5. |
Промывка |
CH3CN абс. |
250 |
10.0 |
|
6. |
Конденсация |
0.05 М р-р мономера*, 0.25 M р-р этилтиотетразола в CH3CN абс. |
50 / 12.5 50 / 31 |
250.0 |
|
7. |
Промывка |
CH3CN |
60 |
1.2 |
|
8. |
Кэпирование |
CpB (16% N-MeIm в THF) CpA (Ac2O/2,6-лутидин/THF (1:1:8)) |
130 / 1268 100 / 525 |
24.2 |
|
9. |
Промывка |
CH3CN |
30 |
31.8 |
|
10. |
Окисление |
0.02 М I2 в THF / Py / H2O (90:1:9) |
160 / 13 |
66.0 |
|
11. |
Повторить п. 1-10 | |||
|
12. |
Конец синтеза Повторить п. 1-4 |